Assessment and optimization of new applied spectroscopic techniques using functional data analysis: application to non-invasive sensing of sustained hyperglycemia

• Autores: Aldo Luis Moreno Oyervides
• Directores de la Tesis: Pablo Acedo Gallardo (dir. tes.) , María del Carmen Aguilera Morillo (codir. tes.)
• Lectura: En la Universidad Carlos III de Madrid ( España ) en 2020
• Idioma: español
• Tribunal Calificador de la Tesis: Marta Ruiz-Llata (presid.) , Ana María Aguilera del Pino (secret.) , Peter Haring Bolivar (voc.)
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  • Tesis en acceso abierto en: e-Archivo
• Resumen

  • Hoy en día, la espectroscopia de ondas milimétricas y THz comprenden un gran campo de investigación que se enfoca en gran parte al desarrollo de técnicas e instrumentos nuevos y mejorados en aplicaciones prácticas tales como diagnósticos médicos, controles de seguridad y el control de procesos industriales; esto se debe principalmente a su alcance para elucidar y caracterizar la materia de forma remota y no invasiva mediante el uso de radiación electromagnética no ionizante. Dichos instrumentos se basan en técnicas espectroscópicas enfocadas generalmente a medir la reflexión, absorción y/o transmisión de una muestra mediante su interrogación espectral sobre una banda de frecuencia determinada, siendo esta la razón por la que el uso de técnicas espectroscópicas resulta en la adquisición de múltiples espectros que contienen la evolución de la reflectancia, absorbancia y/o transmitancia de la muestra interrogada en función de las frecuencias (longitudes de onda) medidas dentro de una banda de frecuencia de interés. Posteriormente, el objetivo principal es encontrar una característica espectral que permita modelar la composición química de la muestra bajo estudio: ya sea a uno o más de sus constituyentes o alguna propiedad de forma específica. Dicho objetivo es considerablemente obstaculizado cuando existe un solapamiento entre las respuestas espectrales de los componentes involucrados en la muestra bajo estudio, lo que generalmente ocurre en aplicaciones como las biomédicas donde la interrogación espectral se desarrolla sobre una muestra biológica que contiene múltiples especies químicas con propiedades de reflexión, absorción y/o transmisión que son muy similares entre sí. Además, existen otros factores comunes que afectan significativamente el modelamiento de los datos espectrales medidos en aplicaciones biomédicas tales como el ruido instrumental e interferencias asociadas a factores ambientales y fisiológicos, cuyo impacto varía dependiendo de la técnica espectroscópica utilizada. Por otro lado, el solapamiento de respuestas espectrales de los constituyentes de una muestra obliga a considerar intervalos de frecuencia más amplios, que aunado a las altas resoluciones en frecuencia (o tiempo) de los instrumentos espectroscópicos modernos y las tecnologías actualmente disponibles para la recolección y almacenamiento de datos, resulta en la adquisición de espectros medidos sobre un largo número de frecuencias. Por lo tanto, el procesamiento y análisis de los datos espectrales son tareas desafiantes a la hora de desarrollar nuevos sistemas de espectroscopia aplicada en bioingeniería, que a menudo son abordadas mediante el uso de métodos estadísticos con el fin no solo de extraer la información deseada de los datos espectrales, sino también como parte del proceso de calibración de la técnica o el instrumento. En este sentido, el uso de técnicas estadísticas adecuadas para el procesamiento y análisis de los espectros medidos es vital para que un sistema de espectroscopia aplicada alcance su máximo potencial. Actualmente los métodos estadísticos más utilizados para el procesamiento y análisis de datos en espectroscopia aplicada son los comprendidos en el marco del análisis multivariante. Este enfoque suele conducir a estructuras de datos con problemas de dimensionalidad y de multicolinealidad que requieren el uso de técnicas para la reducción de dimensionalidad o selección de variables como paso previo al modelamiento de los datos. Sin embargo, el uso de este tipo de técnicas estadísticas en la espectroscopia aplicada limita la interpretación del análisis sobre la respuesta espectral en términos de las contribuciones originales de las frecuencias medidas durante la interrogación espectral.

    El trabajo presentado en esta tesis doctoral tiene dos objetivos principales: en primer lugar, evaluar la aplicabilidad de un nuevo enfoque que utiliza espectroscopía de ondas milimétricas para el diagnóstico y monitorización in vivo y de forma no invasiva de la hiperglucemia sostenida asociada típicamente a la Diabetes Mellitus (DM) y, en segundo lugar, motivar e impulsar el uso de los métodos estadísticos desarrollados bajo el marco del Análisis de Datos Funcionales (ADF) para el procesamiento y análisis de datos espectrales en el desarrollo, evaluación y calibración de nuevos sistemas de espectroscopia aplicada, especialmente para aplicaciones biomédicas. Los métodos estadísticos desarrollados para el análisis de datos funcionales toman en cuenta la naturaleza continua intrínseca asociada al proceso de interrogación espectral, aliviando así los problemas de dimensionalidad y multicolinealidad que surgen comúnmente al aplicar análisis multivariante a los datos espectrales medidos sobre dominios continuos. De esta forma los espectros son analizados como trayectorias muestrales de una función continua con soporte en la banda de frecuencia medida y analiza las tendencias de las curvas espectrales en vez de considerar los valores puntuales de las frecuencias medidas. La validación del enfoque propuesto incluye varias pruebas experimentales realizadas con modelos animales representativos de diferentes estados de hiperglucemia y una prueba piloto de validación diagnóstica en los seres humanos con pacientes de DM tipo 1.

    Las pruebas experimentales se realizaron mediante un espectrómetro de banda W (75 GHz – 110 GHz), construido específicamente para esta investigación, capaz de adquirir los espectros resultantes de las señales de reflexión y transmisión a partir de la interrogación espectral realizada in vivo y de forma no invasiva sobre muestras biológicas. El espectrómetro utiliza cadenas de multiplicación para alcanzar las frecuencias de la banda W a partir de un barrido en frecuencias generado en la banda Ku (12 GHz – 18 GHz) y utiliza receptores de banda W (con mezcladores subarmónicos) para medir una referencia de la señal generada y las señales resultantes de la reflexión y transmisión de la muestra biológica en términos de los parámetros de amplitud y fase. Todas las señales medidas por los receptores de banda W durante la interrogación espectral son muestreadas en una frecuencia intermedia de 1.8 MHz a una tasa de muestreo de 10 MHz mediante un osciloscopio digital multicanal para su posterior filtrado y procesamiento utilizando una rutina en LabVIEW. El programa de LabVIEW fue diseñado para configurar los parámetros de la interrogación espectral y para procesar las señales muestreadas en tiempo real como un amplificador lock-in multicanal. Finalmente, el programa almacena la amplitud (RMS) de las señales detectadas y los desplazamientos de fase en las señales de reflexión y transmisión con respecto a la señal de referencia. Todos los datos obtenidos durante las pruebas experimentales fueron procesados y analizados utilizando métodos estadísticos para el análisis de datos funcionales debido a su idoneidad para abordar los escenarios espectroscópicos complejos como los que se encuentran comúnmente en el marco de las aplicaciones biomédicas.

    La primera etapa experimental para evaluar el sistema propuesto consistió en la exploración y caracterización de la respuesta espectral in vivo de ratones normoglucémicos e hiperglucémicos en la banda W. Es importante señalar que, considerando la falta de información sobre las características espectrales de la muestra biológica in vivo, la complejidad de su modelamiento matemático y la dificultad para aislar la respuesta espectral de componentes biológicos específicos en este tipo de escenarios, las pruebas experimentales se diseñaron bajo un enfoque de perfilamiento espectral no específico. De este modo, utilizando una estrategia de análisis similar a la adoptada en la metabolómica no dirigida, nos enfocamos en comparar de forma cualitativa los perfiles espectrales en la banda W obtenidos de los modelos animales representativos de normoglucemia y diferentes estados de hiperglucemia sostenidos con el fin de detectar variaciones espectrales características en la banda W asociadas a metabolismos hiperglucémicos. Este enfoque nos permitió considerar de forma colectiva las características espectrales de todos los constituyentes de la muestra (sin tener que identificar metabolitos individualmente) y nos proporcionó una perspectiva más amplia a la hora de estudiar la aplicabilidad de la técnica espectroscópica propuesta como herramienta diagnóstica en el cuidado de la diabetes; lo que es especialmente útil durante las primeras etapas en el desarrollo de un nuevo sistema de diagnóstico. Las medidas no invasivas proporcionadas por el sistema descrito se efectuaron directamente sobre un pliegue de piel tomado de la espalda de los ratones. El pliegue de piel se colocó entre dos guías de onda rectangulares de forma troncocónica y extremo liso con una separación aproximada de 1 mm (separación mínima necesaria para sujetar el pliegue de piel) y alineadas previamente. Los ratones fueron anestesiados durante el proceso de medida que tarda aproximadamente 45 segundos para reducir al mínimo su movimiento muscular y prevenir riesgo de daño autoinfligido.

    Un primer experimento fue diseñado para estudiar la influencia de diferentes estados glucémicos y otras variedades físicas entre distintas cepas de ratones (color de pelo, tipo y grosor de piel, etc.) en la medida no invasiva proporcionada por el sistema. La muestra de ratones consistió en 10 ratones normoglucémicos: 8 ratones sanos con un nivel de glucosa en sangre esperado de 100 mg/dl y dos ratones con deficiencia de leptina (obesos) que fueron tratados durante un mes previo a las medidas para normalizar sus niveles de glucosa en sangre, y 10 ratones hiperglucémicos: 5 ratones con una diabetes desarrollada y 5 ratones obesos con prediabetes. Además de la medida no invasiva, también se registró el nivel de glucosa en sangre y el grosor del pliegue de piel de cada ratón al momento de la medida. Los espectros medidos asociados a la reflectancia y transmitancia de las muestras biológicas fueron analizados bajo un enfoque no supervisado mediante un Análisis de Componentes Principales Funcionales (ACPF) con el fin de detectar las fuentes de variación más relevantes en la respuesta espectral y estudiar posibles agrupaciones naturales entre los ratones debido a las fuentes de variación detectadas. De este análisis se pudo comprobar que la intensidad transmitida a través del pliegue de piel no solo permite discriminar entre ratones normoglucémicos y ratones hiperglucémicos, si no también entre los niveles de hiperglucemia asociados a una prediabetes y una diabetes desarrollada en los modelos animales. Además, los resultados obtenidos indicaron que tal discriminación es robusta ante las variedades biológicas entre las distintas cepas de los ratones y el grosor de la piel (o grasa subcutánea), y no es determinada por el nivel de glucosa en sangre instantánea en el momento de la medida. Estas evidencias condujeron a la realización de dos pruebas experimentales diseñadas con el fin de validar la detección no invasiva de hiperglucemia sostenida sobre una muestra independiente de ratones y estudiar la capacidad del enfoque propuesto para detectar cambios graduales en el metabolismo de los ratones asociados a distintos estados glucémicos sostenidos. Los datos obtenidos durante la segunda prueba experimental, que incluyó una nueva muestra con 18 casos hiperglucémicos y 15 casos normoglucémicos, se analizaron mediante un modelo de regresión logística funcional basado en las componentes principales funcionales estimadas sobre los espectros correspondientes a la intensidad transmitida a través de la muestra biológica. La estabilidad del modelo de clasificación en tasa de predicción y bondad de ajuste se estudió mediante un análisis de prueba múltiple con cien iteraciones seleccionando la muestra de entrenamiento de forma aleatoria en cada iteración. La tercera prueba experimental consistió en evaluar la evolución de la respuesta espectral sobre un grupo de 16 ratones con una diabetes fármaco-inducida durante un periodo de dos semanas (a partir de que finalizó el proceso de inducción) mediante las componentes principales funcionales estimadas para cada medida por separado. Los análisis realizados en estas dos últimas pruebas experimentales corroboraron satisfactoriamente la aplicabilidad del enfoque no invasivo para predecir la condición de hiperglucemia sostenida en los modelos animales y además demostraron que es posible obtener un indicador cuantitativo que permita monitorear su nivel de glucemia sostenida con al menos cuatro días de ocurrencia.

    Una ventaja significativa de los métodos utilizados y que se destaca durante el análisis estadístico es que permite estudiar de forma cualitativa y cuantitativa la contribución de las frecuencias medidas en la discriminación de los espectros, lo que nos permitió identificar un subintervalo de frecuencias que retiene las características espectrales más relevantes asociadas a la predicción de hiperglucemia sostenida en los modelos animales. De esta forma, la extracción de información obtenida mediante el ADF sobre los espectros medidos nos llevó a replantear una versión optimizada del enfoque espectroscópico propuesto: simplificando la medida no invasiva a la intensidad transmitida a través del tejido y reduciendo de forma significativa el ancho de banda requerido para la interrogación espectral (tiempo de operación).

    Los excelentes resultados obtenidos de las pruebas experimentales sobre los modelos animales proporcionaron fuerte evidencia de que el enfoque espectroscópico propuesto provee un indicador del nivel de glucemia sostenida en ratones similar a la prueba invasiva HbA1c que es ampliamente utilizada en el diagnóstico y seguimiento de la diabetes en humanos. Por lo tanto, la siguiente prueba experimental se diseño como una prueba piloto de validación diagnóstica en seres humanos con la medida de HbA1c como referencia. Para la prueba piloto se considero una muestra de 30 sujetos: 10 voluntarios no diabéticos y 20 pacientes diagnosticados con diabetes tipo 1: 10 con buen control metabólico (HbA1c < 7%) y 10 con mal control metabólico (HbA1c > 7%). La medida no invasiva se efectuó directamente sobre un pliegue de piel ubicado en el primer espacio interdigital de la mano derecha (entre el pulgar y el dedo índice) con una separación aproximada entre las guías de onda de 1.8 mm. La prueba piloto de validación diagnóstica se desarrollo como un estudio longitudinal debido al periodo estándar de tres meses sugerido entre evaluaciones de la prueba HbA1c con un total de tres visitas programas para los participantes durante un periodo de 7 meses. Los espectros medidos durante las visitas se analizaron inicialmente por separado (análisis no longitudinal) modelando el valor de HbA1c (variable respuesta escalar) mediante modelos de regresión funcional con la respuesta espectral medida como variable predictora funcional. Finalmente, los datos espectrales longitudinales se analizaron mediante Análisis de Componentes Principales Funcionales Longitudinales (ACPFL) y métodos de regresión funcional longitudinal: Regresión Funcional Longitudinal Penalizada (RFLP) y Regresión sobre Componentes Principales Funcionales Longitudinales (RCPFL). Este escenario demostró el gran alcance del ADF en la espectroscopia aplicada ya que provee de una metodología estadística capaz de analizar los espectros observados de forma longitudinal simultáneamente considerando la variación intersujeto e intrasujeto, sin perder la interpretación de la contribución original de las frecuencias medidas. El análisis estadístico no longitudinal indicó que existe una buena relación lineal entre la prueba HbA1c y la medida no invasiva proporcionada por el sistema propuesto, sin embargo, dicha relación se ve considerablemente afectada por la fuerte absorción que presenta el tejido humano y la variación en la respuesta espectral de los sujetos entre visitas. Esta variabilidad entre visitas en la respuesta espectral se estudió con más detalle desarrollando un ACPFL sobre los espectros longitudinales, que demostró que la variación intersujeto permite discriminar a los sujetos no diabéticos de los diabéticos mediante características espectrales muy similares a las observadas en los modelos animales. Esto claramente señala la existencia de un componente biológico (o componentes biológicos) con líneas espectrales características que coinciden con las frecuencias identificadas durante ambas etapas de la evaluación experimental (modelos animales y humanos), y que esta fuertemente relacionada con la presencia de hiperglucemia sostenida (posible biomarcador). Finalmente, considerando la variación intersujeto e intrasujeto en el análisis de regresión mediante los modelos de RFLP y RCPFL se consiguió mejorar significativamente la predicción del valor de HbA1c de los sujetos medido durante todas las visitas, con un coeficiente de determinación obtenido por encima de 0.97 (en ambos modelos) y la raíz de la desviación cuadrática media (RDCM) inferior a 0.24.

    En general, estos resultados obtenidos de la prueba piloto para validación diagnóstica en humanos demuestran que un simple espectrómetro capaz de medir la transmisión de la muestra biológica en la banda W, combinado con las herramientas de análisis estadístico adecuadas, proporciona un enfoque potencial para el desarrollo de una herramienta de diagnóstico no invasiva enfocada a la detección in vivo de la glucemia sostenida en humanos. Esto significaría un claro avance en el manejo y en el diagnóstico de la diabetes, ya que podría sustituir la prueba invasiva de HbA1c, que es actualmente la herramienta estándar en la práctica médica utilizada para el diagnóstico y seguimiento de la DM.