Resumen de Herramientas bioinformáticas para el diagnóstico genético preimplantacional mediante secuenciación masiva

Natalia Castejón Fernández

• español

  El diagnóstico genético preimplantacional de aneuploidías (DGP-A) se define como el procedimiento que analiza si los embriones están libres de anomalías cromosómicas para ser transferidos al útero materno. La técnica preferida empléa la secuenciación masiva (NGS). Durante la elaboración de la librería los fragmentos de ADN a secuenciar no se originan por fragmentación del material original sino por amplificación a través de cebadores aleatorios. Ésto produce sesgos que generan dos fuentes de artefactos: una por hibridación de cebadores aleatorios en ADN amplificado en lugar de ADN genómico; la segunda por amplificación de la librería tras la ligación del adaptador. Esto se denomina duplicados de PCR y puede enmascarar los resultados.

  La NGS puso de manifiesto el fenómeno del mosaicismo (dos o más líneas celulares distintas en un embrión). La bibliografía recoge que estas anomalías producen bajos ratios de implantación en procesos de reproducción asistida. Algunos estudios afirman que las tasas de éxito en transferencia de embriones con bajo porcentaje de mosaicismo son en realidad falsos positivos. Otras corrientes acusan que las técnicas presentan falsos negativos, describiendo casos donde embriones determinados como euploides engendraron bebés mosaico. En cualquier caso, todos coinciden en que la determinación del porcentaje exacto de aneuplodía es un elemento crítico para determinar la probabilidad de implantación de un embrión mosiaico.

  La presente tesis desarrolla un algoritmo destinado al filtrado de duplicados y artefactos de PCR, MiNFilterDups y un algoritmo que permite la detección de porcentajes bajos de aneuploidía y determinación del nivel de mosaicismo, el MiNmos. Para su validación se generaron varios conjuntos de archivos a partir de los datos de embriones de pacientes.

  El DGP también puede ser aplicado en determinación de embriones libres de enfermedades monogénicas (DGP-M). Las técnicas son variadas pero todas deben enfrentarse al fenómeno ADO (Allele Drop-Out) o amplificación preferencial de un alelo frente al otro. Esto genera incertidumbre respecto al resultado emitido ya que si un locus aparece como homocigoto y no se detecta la alteración en estudio, cabe la posibilidad de que el alelo mutado no haya sido amplificado, constituyendo un falso negativo desencadene la transferencia de un embrión enfermo. Para evitar esto, se analizan varios polimorfismos adjacentes al locus mutado y se determina si cosegregan con el alelo mutado o el silvestre.

  Aunque la gran densidad a lo largo del genoma constituye una ventaja, secuenciar todos los polimorfismos de una región es redundante y costoso; se puede reducir el número empleando estrategias de selección de tagSNPs (polimorfismos que representan a otros) basadas en el desequilibrio de ligamiento. Multitud de parámetros permiten calcular si un SNP puede ser o no útil en la predicción de otros, pero la selección de polimorfismos útiles para DGP-M requiere considerar más factores que la correlación, pues la mayoría de técnicas obtienen paneles que no son útiles para distinguir fenómenos de recombinación. MiNtagSNP es un algoritmo de selección de tagSNPs útiles en DGP-M, que permite, determinar los polimorfismos presentes en cada embrión y descartar aquellos que porten la alteración. La validación in silico se realizó empleando datos simulados a partir de las principales bases de datos de polimorfismos. Para la validación in vitro, se comprobó la concordancia de los resultados con respecto a los métodos tradicionales. Finalmente, se implementó en el laboratorio, y se realizó un seguimiento de los casos en un periodo de tiempo.

  Podemos concluir que el principal objetivo de los algoritmos desarrollados en el marco de esta tesis persigue el diseño de un método de análisis rápido y eficaz que permita aunar los procesos de análisis de DGP-A y DGP-M mediante secuenciación por NGS a partir de una biopsia única.

• English

  Preimplantation Genetic Testing for Aneuploidy (PGT-A) is defined as the analysis of embryos for chromosomal abnormalities before being transferred to the mother's uterus. The preferred technique for PGT-A is Next Generation Sequencing (NGS). Library elaboration protocol is slightly different with respect to other genetic diagnostic techniques, since DNA fragments to be sequenced do not originate by fragmentation but by amplification through random primers that bind to the original DNA. Biases occur during the process that generate artifacts due to the hybridization of random primers in amplified DNA instead of genomic DNA or the amplification of the library after adapter ligation, named PCR duplicates, which can mask the results. NGS techniques reveal a phenomenon that had gone unnoticed, mosaicism (several cell lines in an embryo). Bibliography shows these anomalies produce low implantation rates. Furthermore, some studies affirm that the success rates in embryo transfers with a low percentage of mosaicism are actually false positives. On the other hand, other studies accuse that the techniques present false negatives, reporting cases where embryos determined as euploids generated mosaic newborns. Due to this fact, developing a precise method for determining mosaicism, controlling levels of sensitivity and specificity is an essential.

  We present MiNFilterDups, an algorithm for filtering duplicates and PCR artifacts and a second algorithm, MiNmos, to detect low percentages of aneuploidy and determine the level of mosaicism. For validation, several sets of files were generated from embryos of patients who had undergone an assisted reproduction process.

  Molecular diagnosis can also be applied in the determination of monogenic diseases named, PGT-M (Preimplantation Genetic Testing to Monogenic Diseases). All of the techniques must face the ADO (Allele Drop-Out) phenomenon (preferential amplification of one allele) which causes a heterozygous locus appears as homozygous because one of the two alleles is not amplified. This cause some uncertainty regarding the result issued since the alteration under study is not detected, it is possible that the mutated allele has not been amplified, constituting a false negative that can trigger the transfer of a diseased embryo. To avoid this problem, generally not only the mutation is studied, but several polymorphisms adjacent to the mutated locus are also analysed. Through a linkage study, it is determined whether these polymorphisms cosegregate with the mutated allele or with the wild one.

  The advantage of using SNPs is the high density that present throughout the entire genome, allowing embryos to be discarded if the polymorphisms associated with the affected chromosome are present. Sequencing all SNPs in a region is redundant and expensive; Fortunately, the number can be reduced by tagSNP strategies (polymorphisms that represent others). There are many parameters that allow us to calculate whether or not one SNP may be useful in predicting others, but in the specific case of selecting useful polymorphisms for PGT-M, consideration of more factors than the correlation between them is required to obtain panels that are useful when it comes to distinguishing recombination phenomena. We present MiNtagSNP, an algorithm for the selection of tagSNPs useful in PGT-M, which allows to discard embryos that carry the alteration. In silico validation was performed using simulated data from the main polymorphism databases. For the in vitro validation, results were checked for agreement with traditional methods. Finally, methodology was implemented in the laboratory, and the cases were followed up over a period of time.

  Thus, we can conclude that the main objective of the algorithms presented within the framework of this thesis pursues the design of a fast and efficient analysis method that allows combining the analysis processes of PGT-A and PGT-M by NGS techniques from of a single biopsy.