Resumen de Desarrollo de un microarray para la identificación de genes de resistencia a patógenos de interés industrial en rodaballo (" Scophthalmus maximus" )
Adrián Millán Pérez
El rodaballo (Scophthalmus maximus; Scophthalmidae; Pleuronectiformes) es un pez plano de gran importancia para la acuicultura en Europa, y especialmente en Galicia. Las enfermedades infecciosas en los peces cultivados constituyen uno de los factores limitantes del éxito y viabilidad de la acuicultura en todas las etapas de la producción. Aeromonas salmonicida y Philasterides dicentrarchi son dos de los patógenos que causan mayores pérdidas en la producción del rodaballo, pero poco se sabe acerca de la interacción hospedador-patógeno y los mecanismos moleculares que puedan conferir resistencia a estas enfermedades. En el presente estudio se ha analizado la respuesta inmune del rodaballo frente a estos dos patógenos de interés industrial mediante una estrategia de genómica funcional, que incluyó el desarrollo de una base de datos de ESTs, el diseño de un oligo-microarray y su aplicación para la identificación de genes y funciones génicas reguladas a lo largo de una serie temporal en tres órganos relacionados con el sistema inmune.
A partir del ARNm de hígado, riñón anterior y bazo de individuos infectados y controles se construyeron tres librerías de ADNc que se utilizaron para la secuenciación masiva de ESTs. De esta forma se ampliaron considerablemente los escasos recursos genómicos existentes en el rodaballo. Estas secuencias fueron gestionadas mediante una base de datos desarrollada con herramientas bioinformáticas propias y públicas. De las 3.482 secuencias únicas de la base de datos, el 49,3% no mostraron similitud significativa con secuencias conocidas y el 23,4% pudieron anotarse y clasificarse usando los términos GO. Más del 25% de los genes anotados en la base de datos aparecieron relacionados con la defensa o inmunidad. La base de datos de ESTs resultó también de gran utilidad para la identificación y desarrollo de marcadores asociados a genes de interés, así como para diseñar por primera vez un oligo-microarray en rodaballo para el análisis de la respuesta inmune. El microarray se constituyó finalmente con 2.716 oligos de las 3.482 secuencias únicas existentes en la base de datos. El análisis de las fuentes de error mediante un diseño jerarquizado y aplicando un análisis de la varianza (ANOVA) de efectos aleatorios permitió comprobar la elevada reproducibilidad de la señal (r>0,99) y diseccionar la variabilidad asociada a los diferentes factores estudiados. El factor biológico representó la principal fuente de variación. Los datos obtenidos sugieren que este oligo-microarray representa una herramienta robusta para analizar los perfiles de expresión génica y detectar genes diferencialmente expresados relacionados con la respuesta a patógenos del rodaballo.
El análisis de los perfiles de expresión génica permitió obtener un mapa de genes bloqueados por órgano. Además, se detectaron 536 genes diferencialmente expresados (DE: 19,7% del total) a lo largo de los puntos temporales y órganos analizados. La respuesta a la infección con A. salmonicida fue mucho más intensa que la detectada frente a P. dicentrarchi. Los genes regulados fueron clasificados según los términos GO en tres grandes categorías relacionadas con el sistema inmune (56,1%), con el metabolismo (33,7%) y con los procesos celulares (10,2%). El hígado fue el más reactivo y específico (290 genes: 65,5% del total) de los órganos estudiados, seguido del bazo (262: 44,3%) y el riñón anterior (185: 28,1%). La función inmune resultó progresivamente más importante en hígado, bazo y riñón anterior, al revés de lo que se observó con el metabolismo y el transporte. Comparando los genes regulados entre los dos patógenos, se observaron 315 genes específicos de respuesta a A. salmonicida y sólo 65 a P. dicentrarchi, compartiéndose 156. Al agrupar los genes regulados por funciones, se observó una distribución de funciones muy similar entre los tres órganos. El análisis comparativo de los patrones de expresión de los genes regulados por órganos permitió detectar 54 genes que mostraron diferencias significativas en respuesta a A. salmonicida y 12 en respuesta a P. dicentrarchi. Los genes inmunes regulados en respuesta a A. salmonicida y P. dicentrarchi comprendieron la respuesta inmune innata y la adaptativa. En el presente estudio se detectó sobre-expresión de la ¿-2 macroglobulina en respuesta a P. dicentrarchi, pero infra-expresión en respuesta a A. salmonicida. Todo el sistema del interferón, incluyendo los diferentes genes inducidos por su respuesta y la proteína MX, se mostró sobre-expresado en respuesta a Aeromonas e infra-expresado en respuesta a Philasterides. La presentación de antígenos por el MHC I también se detectó sobre-expresada en respuesta a Aeromonas. Se identificaron además dos formas diferentes del complemento C3 sobre-expresadas, pero también otras del C9 sobre-expresadas. El componente C4 se mostró sobre-expresado sólo en respuesta a Aeromonas, mientras que en respuesta a Philasterides sólo se activó el C8. Los datos de expresión obtenidos con qRT-PCR mostraron una correlación elevada y altamente significativa (0,952: P<0,001) con los obtenidos con el oligo-microarray.
Este estudio representa el análisis preliminar de los perfiles de expresión de los genes regulados en respuesta a las infecciones con A. salmonicida y P. dicentrarchi. Se han detectado numerosos genes regulados que proporcionan nuevas herramientas para la comprensión de los modelos de infección en rodaballo, aunque también se identificaron otros muchos cuyas funciones están por definir. Los trabajos desarrollados a partir de esta aproximación inicial deberán profundizar en su conocimiento y en sus roles en la respuesta a las infecciones y en la inmunidad. Los datos obtenidos permitirán avanzar en la mejora sanitaria del cultivo comercial del rodaballo mediante su aplicación en planes de selección para la consecución de reproductores más resistentes a estas patologías.
